Kedves Olvasóim!
E havi bejegyzésemben is olyan témát tárgyalok, amivel mostanában foglalkozom, ez pedig a nitrációs esemény megjósolhatósága és "kémcsőben történő kimutatása".
Először is szót ejtek a tirozin nitrációs reakcióról. A NO származéka, a peroxinitrit (ONOO-) képes specifikus reakcióba lépni bizonyos fehérjék bizonyos tirozin aminosavával. Ennek eredményeképpen a tirozin aromás gyűrűjének egyik orto szénatomjához egy nitro-csoport (-NO2) kapcsolódik (lásd 1. ábra).
Ez megváltoztatja a tirozin sztérikus tulajdonságait és töltésviszonyait, ami végső soron a fehérje konformációjának és aktivitásának megváltozásához vezet. Vagyis a ONOO- a fehérje aktivitását képes poszttranszlációs módon szabályozni. A reakció specifikus, ami azt jelenti, hogy nem minden fehérje nitrálódik, és egy fehérjén belül nem az összes tirozin aminosav nitrálódik.
A kutatók munkáját igencsak megkönnyíti manapság az, hogy kidolgoztak olyan algoritmusokat, amelyekkel képesek vagyunk megjósolni, hogy az adott fehérje nitrálódik-e, és ha igen, akkor melyik pozíciójú tirozin aminosaván.
Így szűkíthető a vizsgálati kör, és egyes fehérjékre célzottan lehet in vitro és in vivo kísérleteket tervezni.
Az első (és szerintem a leginkább felhasználóbarát) ingyenesen elérhető program a GPS-YNO2 (Liu és mts. 2011, http://yno2.biocuckoo.org/).
A felhasználói felület egyszerű (lásd 2. ábra): a fehérje aminosav szekvenciáját (FASTA formátumban) be kell másolni a megfelelő mezőbe, meg kell adni a hibahatárt (treshold; low, medium, high) és a "submit" gombra kattintva a felső táblázatban megkapjuk a lehetséges nitrációs pozíciókat.
Ezek után, amennyiben pozitív eredményt kapunk a lehetséges nitrációra nézve, ezt a fehérjét alá lehet vetni részletesebb vizsgálatoknak.
In vitro kísérletekben a tisztított fehérjét reagáltatják ONOO- -val (általában egy donor vegyületet használnak, ami a SIN-1), majd Western blot analízissel detektálják a 3-nitrotirozinnal szemben mutatott immunreakciót, vagyis igazolják a nitráció megtörténtét. Ezek mellett az enzimfehérje aktivitását is kimutatják szintén immunreakcióval.
Példaként említhető Melo és munkatársai 2011-es cikke, melyben a glutamin szintetázt (GS1 és GS2) peroxinitrittel (PN) inkubálták és az enzim aktivitásának csökkenését és a nitráció fokozódását (NO2-Tyr) tapasztalták (lásd 3. ábra). Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a ONOO- csökkenti a glutamin szintetáz aktivitását nitráció által.
Továbbiakban in vivo kísérleteket is érdemes végezni, vagyis növényeket kezelni peroxinitrittel és megmérni bennük az enzim aktivitását. Illetve kezelt növényből össz enzimkivonatot készíteni, és abban megvizsgálni az immunoreakció mértékét. Majd tömegspektrometriás analízissel azonosítani a nitrálódott fehérje sávot alkotó fehérjéket (bár ez utóbbi eljárás meglehetősen költséges).
Ez a bejegyzésem sem sikerült túl "könnyedre", de szeretem arról a témáról készíteni az írást, amivel éppen foglalkozom. Egy jövőbeli OTKA pályázat tudományos programját tervezem, és ennek kapcsán gondolkodom egy ilyen in vitro rendszer alkalmazásán is.
Jövő hónapban ismét jelentkezem!
